技術原理

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。

在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合，可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

實驗方法

Step1：細胞培養(yǎng)

Step2：轉染或藥物處理

Step3：細胞收集

Step4：加凋亡試劑

Step5：上機檢測

案例展示

技術總結

1、考慮到進行流式時需要用到對照組細胞設置空白組（用于調節(jié)電壓）和單染組細胞（用于調節(jié)補償），因此要求該組細胞量較其他組多

2、如發(fā)現細胞密度偏低，細胞量較少，則適當增加離心時間。收集細胞時，應該連同上清一起收集，同時胰酶消化時間不宜過長，否則容易引起假陽性

3、檢測細胞經過轉染等處理后可能會帶有自發(fā)熒光，應注意選擇凋亡試劑盒的顏色通道 如：帶綠色熒光時，應選擇7AAD試劑盒

4、細胞鋪板應選擇細胞狀態(tài)良好的時候進行，且避免反復吹打

5、流式檢測細胞樣本：細胞樣品準備時，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，不得使用細胞刮刀進行操作，胰酶消化細胞時切忌消化過頭或沒有完全打開細胞間隙

送檢與交付標準