技術(shù)原理

自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。

標(biāo)記及追蹤LC3以及自噬流的變化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是穩(wěn)定的熒光表達(dá)基團(tuán)，不受外界影響。由于自噬小體進(jìn)入第二階段后，與溶酶體進(jìn)行融合，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體由于溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，可以導(dǎo)致PH下降，GFP淬滅，因此，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進(jìn)程受阻。mRFP是一直穩(wěn)定表達(dá)的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點(diǎn)比例來評價自噬流進(jìn)程。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1：細(xì)胞培養(yǎng)

Step2：轉(zhuǎn)染或藥物處理

Step3：細(xì)胞收集

Step4：添加LC3-GFP-RPF病毒感染

Step5：熒光檢測

結(jié)果展示

自噬流

自噬誘導(dǎo)劑

a)Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

b)Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

c)Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

d)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

e)Rapamycin：mTOR抑制劑

f)Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

自噬抑制劑

a)3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

b)Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

c)Hydroxychloroquine（羥氯喹）

自噬的評估通常采用多個自噬階段的標(biāo)志物，因?yàn)樽允尚◇w數(shù)量的增加可能是自噬上調(diào)也可能是自噬最后階段降解被抑制所致，所以設(shè)置合適的對照很有必要。

1. 透射電鏡

2. WB檢測標(biāo)志物L(fēng)C3/Atg8和p62/SQSTM1

3. WB檢測Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1

4. 組織蛋白酶Cathepsin活力檢測

5. IF檢測自噬流autophagicflux